基因工程实验引物设计-基因工程引物设计原则

接下来为大家讲解基因工程实验引物设计，以及基因工程引物设计原则涉及的相关信息，愿对你有所帮助。

简述信息一览：

• 1、请问一下PCR中的一些技巧
• 2、引物在基因工程中有哪些作用?
• 3、高中生物试题中引物及T-DNA的应用
• 4、关于基因工程试验中设计引物的问题。
• 5、引物设计如何避免引起移码突变的产生?
• 6、【转】如何设计用于蛋白表达的引物设计自我总结

请问一下PCR中的一些技巧

1、②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

2、溶解引物时，切记使用去离子水或Tris缓冲液，避免蒸馏水的使用。引物在室温下干燥长期保存，溶解后则需冷藏于-20℃以保持稳定。

3、热启动PCR 通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度。最常用的是热启动DNA 聚合酶，常温时该酶活性被抑制，94-95℃加热数分钟后回复正常活力开始反应，这样可以避免起始循环温度下的非特异性扩增，大大提高了PCR反应的灵敏度及特异性。

4、首先，要确定你的模板DNA的浓度大概是多少，太稀和太浓都影响PCR结果，具体数据不记得了，只是我自己跑PCR时因为浓度问题失败了很多次，通过多次调整浓度才得到较理想的结果。

引物在基因工程中有哪些作用?

引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。

引物（primer），又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA***的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。之所以需要引物是因为DNA聚合酶不能从零开始合成DNA，需要在一小段引物（RNA或DNA引物）后面启动DNA的合成。

需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。

与DNA***中的作用类似，但是在细胞内有其他的酶进行这项工作。在PCR技术中，只加入了四种底物和Taq酶，模板。DNA聚合酶只能在有3‘端时才能***下去。决定扩增片段。扩增目的基因，就要根据目的基因两侧序列设计引物，这样只有目的基因扩增了，得到大量目的基因。这是PCR技术的一项重要应用。

pcr中引物的作用：找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。

提供3-OH末端：RNA引物的3-OH末端为DNA聚合酶提供了合成新DNA链的起点。DNA聚合酶只能在已有的DNA链上催化新的核苷酸单元的添加，而RNA引物的3-OH末端能与dNTP形成磷酸二酯键，启动新的DNA链的合成。保持DNA完整性：RNA引物在DNA***过程中起到临时的媒介作用。

高中生物试题中引物及T-DNA的应用

1、在聚合酶链式反应（PCR）中，引物用于指导DNA的扩增，引物与待扩增的DNA序列的两端互补，使DNA聚合酶能够在引物上开始合成新的DNA链。引物在生物学研究和实验中起着重要的作用。它们的选择和设计对于实验的成功和结果的准确性至关重要。

2、其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补。

3、中文：转移DNA 存在位置：土壤农杆菌质粒上的一段DNA 作用：可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中 在新高中生物选修3教材中，目的基因导入植物细胞就是用它来构建运载体的。

4、引物是一小段单链DNA或RNA，引物可以做为DNA***开始时DNA聚合酶的结合位点，在细胞外的条件下，只有通过引物，DNA才可以开始进行***。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

5、DNA，T-DNA）：T-DNA也叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋行成的一种特殊结构。农杆菌Ti（tumor inducing）或Ri（root inducing）质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。

关于基因工程试验中设计引物的问题。

1、如果是，那根据CDS设计引物就可以了，我可以给你打包票没问题。CDS上游和下游的序列在基因工程表达中没有用的。你看下公司设计的引物是不是从CDS的两头设计的，如果上游引物和CDS的前22个碱基能对上就说明上游引物没问题。

2、引物之间的互补配对造成PCR反应时，引物之间互相退火结合，失去和模板结合的能力，从而使聚合酶无法起始聚合反应，所以失效了。正常的引物设计时是很难避免有一小部分碱基能够互补配对的，因此通常只能选择吉布斯自由能最小的引物对。比如20bp长的引物若是有连续的七八个碱基完全配对，那肯定是不行的。

3、s启动子，是花椰菜病毒的启动子，是一种强启动子，被广泛应用于转基因植物中，对它进行改造的许多启动子可以有效提高外源基因的表达水平。同时对该启动子的一些元件进行串联，也可以有效提高外源基因的表达水平。内源启动子和上段相比就是生物自己本身的启动子，不是外源（异源）的。

4、重组引物设计时首先你要确定你选择的两个酶在的酶切位点在质粒的多克隆位点上的排列顺序，这个不能错，不然序列就会接反。

5、引物设计原则 长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2（G十C）十（A十T）]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度（74度），从而降低产物的特异性。G十C含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。

引物设计如何避免引起移码突变的产生?

首先可以在引物设计时选择一系列同源基因序列，尽量避免引物设计处的核苷酸变异，从而减少移码发生的可能性。其次可以考虑引物的长度和结构，引物的长度和中间的序列结构可能会影响移码的发生。设计更多的引物并进行实验的筛选，优选具有更好放缩效果的引物。

为了防止酶切位点引起的移码突变，我们对引物进行微调。在上游引物前添加两个碱基（如CT）并考虑加入无义序列（如ATA），如CTCGAG CG ATGGAGGAGCCGCAGTCAG（1-3 图）。同时，下游引物则直接加上NotI酶切位点，即GC GGCC GC。

表达载体引物：如构建PCMV-TAG2B-gata4载体，需确保起始密码子位置正确，避免移码突变。qPCR引物：跨内含子设计，避免基因组污染，推荐使用Ensembl数据库。

引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

搭桥pcr连不上方法如下：突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点。突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。注意该步一定要用pfu酶，不要用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，从而可能会使产物移码突变。

【转】如何设计用于蛋白表达的引物设计自我总结

网址引物设计和验证的推荐网站为：Primer-Blast。这是一个专门设计用于在已知序列上设计引物或探针的工具。使用BLAST-Primer，您可以输入一个序列或一组序列，并为这些序列设计引物或探针，以便用于PCR扩增或杂交检测等分子生物学实验。需要注意的是，NCBI还有一个网站叫：BLAST。注意二者不要弄混。

优先选择简并度低的氨基酸序列作为引物设计区域，如蛋氨酸和色氨酸仅有一个密码子，这有利于减少引物的复杂性。考虑物种的密码子偏好，选择在该物种中高频率出现的密码子，减少引物的简并性，提升特异性。避免引物在简并碱基处终止，确保3末端尽可能避开密码子的第三位，以增加PCR的成功率。

引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。

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